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在年发现青霉素后的30年里，共有超过20个单一种类的抗生素被鉴定出来。然而，由于科学和经济因素的综合作用，这些救命分子的发现和发展速度放缓，以至于在过去20年中，只有6种新的抗生素被批准，其中没有一种对革兰氏阴性菌有效。新抗生素种类的发现减少，加上多药耐药细菌的进化和耐药机制的水平转移，造成了一场公共卫生危机，预计未来几年只会升级。
最近的努力已经开始重振抗生素的研究，但大多数这项工作已经导致了化合物通过与传统的抗生素类似的机制。例如，最近被批准用于治疗绿脓杆菌引起的耳朵感染的氟喹诺酮类抗生素非那沙星比其他氟喹诺酮类抗生素更有效，因为它在酸性环境中保持其效力。然而，非那沙星仍然易受影响其他氟喹诺酮类药物的相同耐药机制的影响。最近发现的天然产物teixobactin表明，有可能找到选择性杀死细菌而不易产生耐药性的化合物。然而，阿霉素只能对抗革兰氏阳性菌。另一种天然产物，达洛巴汀，最近被发现是特异性的靶向革兰氏阴性杆菌，但对达洛巴汀的抗性相对容易通过bamA的突变实现。因此，仍有强烈的需求来描述具有不同作用机制（MoA）的新抗生素类别，特别是那些针对低耐药率革兰氏阴性的抗生素。
理想的抗生素很难产生抗药性，既能杀死革兰氏阳性菌又能杀死革兰氏阴性菌，而且容易获得。值得注意的是，虽然不易产生耐药性的抗生素在临床上很有吸引力，抗性突变体的筛选是MoA最常用的表征方法，使得无抗性突变体的新型抗生素MoA的表征成为一个重大挑战。表型方法，如大分子合成分析，已经在这种情况下使用过，就像对泰克菌素所做的那样。然而，这些分析只允许用先前描述的MOA对分子进行分类。因此，对于抗生素MoA的从头表征，还需要一种与耐药性无关的方法。
该文献描述一种化合物SCH-，它对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有杀菌作用，包括临床上重要的细菌病原体，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、粪肠球菌、淋病奈瑟菌和鲍曼不动杆菌，没有耐药迹象。在动物宿主模型中，SCH以有效抗生素活性所需的剂量阻断鲍曼杆菌对宿主的低毒性感染。为了快速有效地对SCH-的MoA进行分类，我们使用了最近描述的基于定量成像的方法的变体，即细菌细胞学分析（BCP）。这项研究表明，SCH-通过一种不同于大多数已知抗生素的机制发挥作用。在无法进化抗性突变体的情况下，我们使用热蛋白质组分析、CRISPRi遗传敏感性和代谢组分析来表征SCH-的MoA。利用这种多维的系统级方法，确定了SCH-的候选靶点为二氢叶酸还原酶和细菌膜。经典的酶学、膜透性和极化分析证实了高通量方法所确定的目标。通过对SCH-结构衍生物的分析，证明了该化合物的两个药效团是可以区分的。最后，我们描述了SCH-的一个衍生物，Irresistin-16（IRS-16），其效价提高，证明了在阴道淋病奈瑟菌模型中的有效性。
通过筛选得到化合物SCH-，以前曾被报道为人类PAR-1拮抗剂的化合物。这一发现令人惊讶，因为细菌中没有PAR-1同系物。最近的一份报告表明，SCH可能通过直接作为抗生素发挥作用，提高了中性粒细胞杀死细菌的能力。鉴于专注于表征其抗凝活性的研究表明，至少5mg/kgSCH-在动物中可以安全耐受，并且其作为一种潜在的抗菌剂出现，但没有已知的细菌靶点，通过实验发现，SCH-显著阻碍了多重革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体的生长，包括淋病奈瑟菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌。SCH-对包括耐多药的WHO-L淋球菌和MRSA金黄色葡萄球菌在内的几种耐药病原菌也表现出较强的抗药性。SCH-对金黄色葡萄球菌USA的临床分离株也显示出类似的杀菌活性，这表明其杀菌活性不是物种特异性的。
随后通过实验证明该化合物并不会导致细菌耐药的出现，为了探究该化合物的作用机制，作者们采用了BCP的方法。BCP的逻辑是，具有相似MoA的抗生素导致相似的死亡表型，因此通过量化细菌在死亡时的表现，可以深入了解死亡原因（就像细菌尸检一样）。在这里，将BCP分析应用于37种已知MoA的不同抗生素的训练集以及SCH-。对于每种化合物，我们用5XMIC抗生素处理大肠杆菌lptD小时，用三种染料染色，报告类核细胞形态（DAPI）、膜形态（FM4-64）和膜完整性（SYTOX-Green），并以高分辨率成像细胞。应用机器学习方法对BCP数据进行分类。使用单向MANOVA，我们进行降维以消除自然共价度量的影响，如细胞长度和细胞周长。然后利用单连锁聚类方法，通过邻域表示向量对治疗组进行聚类，使得邻域相似的样本被聚类到一起。该分析表明，SCH-导致的表型死亡状态与其他测试的抗生素不同。
利用热谱和CRISPRi遗传学证明SCH-靶向二氢叶酸还原酶，此外SCH-还破坏了细菌膜电位和渗透屏障。
SCH-由一个吡咯喹唑啉二胺核组成，其一侧被异丙基苯基取代，另一侧则被环丙基取代。为了测试吡咯喹唑啉二胺核心对SCH抗生素活性的作用，我们合成了一种缺少两个侧基的SCH-衍生物（Irresistin-10或IRS-10）。与母体分子SCH-相比，去除异丙基苯基和环丙基增加了抗大肠杆菌lptD的效力，但降低了抗枯草杆菌、MRSAUSA和A.baumaniAB的效力。为了确定SCH-的吡咯喹唑啉二胺核心是否与叶酸代谢膜完整性靶向有关，采用dfrA和folC-CRISPRi超敏试验及流式细胞术定量膜完整性试验检测了IRS-10的活性。CRISPRi超敏反应分析表明IRS10保持抑制叶酸代谢的能力，这表明吡咯喹唑啉二胺核心足以靶向DHFR。然而，与SCH-不同，DiOC2（3）和TO-PRO-3染色显示IRS-10不破坏膜极性或渗透性。我们还证实IRS-10直接抑制纯化大肠杆菌FolA的酶活性。与SCH-（IRS-10ic50=65±19nm）相比，IRS-10被证明是一种更有效的FolA抑制剂，这表明它在细胞培养中对大肠杆菌的增强作用可以通过对DHFR活性的增强来解释。综上所述，这些发现表明SCH-的吡咯喹唑啉二胺核心靶向DHFR。
接下来试图确定异丙苯侧基是否对SCH-的膜靶向特性负责。因此，获得了异丙苯（也称为异丙苯），并确定了其对膜完整性和叶酸生物合成的影响。DiOC2（3）和TOPRO-3染色显示，异丙苯破坏了膜的极性和渗透性。同时，CRISPRi降低dfrA或folC水平对细菌对异丙苯的敏感性没有影响。这些结果支持了这样的结论：SCH-是一种双靶向化合物，其中吡咯喹唑啉二胺核心靶向叶酸代谢，而异丙苯基靶向膜完整性。随着疏水性异丙苯链作用于靶向膜，我们产生了另一个小分子，Irresistin-16（IRS-16），在该分子中，用比异丙苯更疏水的联苯基修饰吡咯喹啉二胺核。从叶酸靶向和膜靶向片段的包含中可以预测到，dfrA和folC-CRISPRi突变体通过DiOC2（3）和PRO-3染色证明对IRS-16和IRS-16的超敏反应破坏了膜的通透性和极性。与IRS-10相比，IRS-16对大多数被测细菌的抗菌活性更强，这表明靶向膜完整性和叶酸生物合成比仅靶向叶酸代谢更为强大。
一种有效的抗生素需要在不杀死哺乳动物宿主的情况下，对目标致病菌有效。为了确定抑制哺乳动物细胞生长所需的浓度，用SCH-和IRS-16这两种具有最强抗生素活性的衍生物处理了几种哺乳动物细胞系。SCH-对PBMC细胞显示出很有希望的结果，因为它们需要的生长抑制剂量比杀死大肠杆菌lptD所需的剂量高10倍以上。然而，SCH-抑制其他哺乳动物细胞系的生长，包括HK-2、HEK和HLF，其剂量与杀死细菌所需的剂量相当。相比之下，IRS-16在影响其他哺乳动物我细胞系生长的剂量比要求的剂量低-0倍。通过将IRS-16在体内进行实验发现，IRS-16具有良好的治疗指标和药代动力学特征，可作为体内淋病感染模型的有效抗生素。
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