一、细胞培养中常见的污染问题

由不同细胞、不同组织器官构成的哺乳动物，其细胞在整体存活时，互相调节、互相依赖，有很好的内环境平衡稳定系统，有特化的应对外来微生物感染、致病因子作用的免疫系统。细胞生活在温度、pH、离子强度、营养成分等相对稳定的状态下。哺乳类细胞在体外培养成活本身就是一项研究。科学家模仿并尽可能创造接近体内的环境，成功地在实验室中培养了各种哺乳类细胞，是20世纪很重要的成就。体外细胞培养的条件近乎苛刻。所有使用物品要洁净、无菌。所有操作过程要在无菌环境中。也就是说细胞培养过程中时刻面临着微生物的污染。由于微生物生长繁殖的速度远远超过哺乳类动物细胞，培养细胞一旦发生污染，就意味着培养的失败。即使细胞侥幸存活，其功能和性质也往往会发生改变，无法作为实验模型进行研究工作。

细胞体外培养过程中，常见的污染包括细菌污染、霉菌污染及支原体污染，还有细胞间的交叉污染。后者只要足够重视，操作不同细胞时使用不同的工具或分别进行即可避免，这不在本文讨论之列。细菌和霉菌污染在显微镜下甚至是肉眼就很容易识别。细菌污染时，培养瓶中的培养液变酸、变浑浊，显微镜下，细胞间大量活跃运动的细小颗粒，细胞大量死亡。霉菌污染时，严重时可见霉菌团块，漂浮在培养液中，显微镜下可见不同形态的霉菌菌丝。只有支原体污染，较难识别。常常对培养细胞的支原体的污染估计不足或被忽略。

已有许多调查及研究显示，美国和欧洲正在使用的细胞系中的支原体污染率为10%～15%。德国微生物和培养细胞保藏中心（DSMZ）的研究者最近的研究显示世界范围内细胞系的支原体污染率在15%～50%之间。我们中心（基础医学细胞中心，科技部科技基础性工作项目）在过去3年内，先后检测过的国内来源的细胞株系，支原体污染率高达60%。

培养细胞中支原体污染的来源包括：

所使用的动物来源的一些产品如血清、工作人员或已被支原体污染的细胞株系。污染培养细胞的支原体一般是寄生于人、牛或狗的少数几种类型。细胞培养上清中支原体的浓度可达10^7/ml，而培养的细胞看起来很正常。不管是肉眼观察还是显微镜下观察，受支原体污染的细胞可无明显变化。但是支原体污染可使研究结果的真实性和可靠性大大下降。由于竞争营养及支原体有毒的代谢产物，支原体污染可显著影响生产用细胞的培养及相应生物技术的发挥，影响生物制品的生产。

二、支原体污染对细胞的影响

细胞感染支原体后，可使细胞增殖缓慢，部分细胞变圆，从培养瓶壁脱落。多数细胞感染后，生长速度、细胞形态等无明显变化。特别是一些肿瘤细胞系株，虽然有支原体污染，细胞仍生长迅速，培养上清仍清亮。有些细胞支原体污染后，形态变化虽不明显，但培养液pH变化明显，更换培养液后几小时内变酸(颜色变黄)。还有的细胞支原体污染可有明显的改变，如生长速度减慢，甚至停止，细胞体积增大，细胞碎片越来越多，培养瓶中细胞与细胞间隙出现膜状沉积，细胞无法传代。

支原体污染对培养细胞功能方面的影响，尚未见专门的研究报道。但确曾有报道有的实验结果仅能在支原体阳性的细胞中得到。也曾有科研人员向我们反映：以前用支原体阳性细胞得出的结果，在相应的无支原体的细胞中不能重复其结果。也曾有利用肿瘤细胞制备的单克隆抗体实为针对所污染的支原体的抗体。还有的科研成果，他人无法重复，也因所用细胞有支原体污染所致。

三、支原体检测及清除的方法

到目前为止，已发现的支原体有30余种。支原体检测的方法主要有培养法、荧光法、电子显微镜法和聚合酶链反应(PCR)法。

培养法的原理是利用营养丰富的培养基，直接对待检细胞、血清等进行支原体培养。观察肉汤培养管是否变浑浊及pH变化情况，浑浊表示支原体阳性；观察琼脂培养基上支原体集落形成情况，至少3周，有集落形成表示支原体阳性。典型的支原体集落呈油煎蛋样。利用扫描电子显微镜或透射电子显微镜的超级放大功能，可直接观察培养细胞中支原体污染情况。

四、应对支原体污染的策略

细胞一旦发生了支原体污染，应当弃之。虽然已有了针对支原体的抗生素及最近出现的所谓支原体清除剂，这些方法只能杀灭细胞外的支原体。有一部分支原体可侵入到细胞内部。我们用扫描电子显微镜观察支原体污染细胞时，也在细胞内看到了支原体。细胞内的支原体可逃避支原体清除处理。这些细胞内的支原体颗粒可再度离开细胞，去污染更多的细胞。所以对支原体污染细胞中清除支原体的工作，实际上是非常困难的，几乎不可能彻底清除支原体。除非是不可替代或无法重新获得的细胞，一般没有必要进行支原体清除工作。

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在科学研究和开发研究中，避免支原体污染及减少支原体污染对科研、开发工作影响的最好方法就是定期对培养的细胞进行支原体检测。这种常规支原体检测可最大限度降低支原体污染，确保排除未知支原体与细胞相互作用而产生的严重后果。尤其是在研究领域，常忽视培养细胞中支原体的污染，或对支原体污染程度估计不足。迫切需要提高认识，加强对培养细胞支原体污染的检测。